研究背景

在骨缺損修復過程中，受損部位會經歷細胞募集、血管重建和新骨形成等一系列生物學過程。生物活性玻璃(bioactive glass, BG) 是一類能釋放功能性離子、參與血管生成與成骨過程的生物材料，可通過釋放功能性離子在血管生成與成骨過程中發揮關鍵作用。銅摻雜生物活性玻璃(CuBG) 能釋放包括Cu²⁺、Ca²⁺和SiO?^4-在內的多種離子，這些離子對組織再生具有促進作用。其中，Cu²⁺通過抑制缺氧誘導因子1α(HIF-1α) 在細胞核內與核外的降解來模擬缺氧效應，從而激活HIF-1信號通路，進一步上調血管內皮生長因子(VEGF) 和內皮型一氧化氮合酶(eNOS) 的表達，增強血管生成能力。此外，CuBG還能激活多種成骨相關信號通路，如MAPK、Wnt/β-連環蛋白和BMP-Smad通路等，富集細胞內成骨相關的miRNA，協同促進骨缺損修復。然而，在早期階段，離子的快速釋放會導致離子濃度升高和堿性增強，從而引發劇烈疼痛、溶血反應及過度炎癥反應，最終阻礙骨再生進程。

源自骨髓間充質干細胞(BMSCs) 的小型胞外囊泡(sEVs) 被認為是一種安全有效的生物制劑，這些囊泡可被遠端細胞攝取，并顯著調節其功能與行為。sEVs不僅能夠保留源細胞的優勢特性，還能避免其潛在缺陷；同時其分子信號具有歸巢效應、循環穩定性以及非免疫原性等特點，可有效募集細胞并促進組織修復。然而，在骨缺損條件下，BMSCs來源的sEVs存在產量有限、促血管生成與成骨能力不足等問題，嚴重限制了其在臨床治療中的應用。

本研究采用CuBG處理BMSCs，制備出小型胞外囊泡(sEVs)，并將其類比為“納米振動激發器"(nano-vibration exciter)。通過激活HIF-1信號通路及其介導的自噬過程，將CuBG釋放的離子信號轉化為生化因子信號，從而更高效地發揮BG的成骨潛能，驅動組織的再生與修復。

1.sEVs的提取和表征

BG(60SiO₂-36CaO-4P₂O₅) 和CuBG(60SiO₂-34CaO-2CuO-4P₂O₅) 納米顆粒均呈現球形結構，具有非晶相結構特征，平均粒徑分別為467.31 nm和307.48 nm。CuBG具有良好的生物相容性，在作用于BMSCs后未引起sEVs粒徑或形態的顯著改變，避免了傳統缺氧培養方法可能引發的細胞凋亡等副作用。CuBG釋放的Cu²⁺通過抑制細胞核外羥化酶(PHD) 對脯氨酸殘基的羥化作用，阻斷細胞核內缺氧誘導因子抑制因子1(FIH-1) 的活性，從而抑制HIF-1α的降解，穩定HIF-1α蛋白。

2.CuBG-sEVs增強成骨活性的機制

CuBG能釋放Cu²⁺、Ca²⁺和SiO?^4-等多種促進組織再生的離子，其中，Cu²⁺通過抑制HIF-1α在細胞核內和核外的降解過程來模擬缺氧效應，從而激活HIF-1信號通路，并上調促血管生成miRNA的表達，特別是miR-210。在缺氧條件下，HIF-1α會進入細胞核，激活自噬相關基因，如微管相關蛋白1輕鏈3(LC3) 和beclin1，并誘導p62蛋白表達，從而調控自噬進程并增強sEVs的生成。此外，CuBG釋放的Ca²⁺和SiO?^4-等其他活性離子，也能夠促進成骨相關miRNA的富集，如miR-218、miR-146a和miR-21。綜上所述，CuBG以HIF-1信號通路及其介導的自噬激活作為核心調控機制，有效提升了CuBG-sEVs的產量并增強其成骨活性。

3.體外血管生成與骨形成

血管生成在骨形成過程中發揮著關鍵作用，能夠輸送組織再生必需的營養素、礦物質、生長因子和氧氣。人臍靜脈內皮細胞(HUVECs) 能夠有效攝取sEVs，進而促進血管的生成。CuBG-sEVs可被HUVECs有效內化，并顯著刺激其遷移能力，顯示出在細胞間通訊的重要潛力。此外，CuBG-sEVs表現出更強的細胞募集能力，這可能與其上調miR-210表達水平有關。在miR-210調控的HIF-1α信號通路激活后，可促進VEGF的釋放，進而誘導趨化因子SDF-1的表達，最終增強細胞募集過程。

此外，CuBG-sEVs能夠有效上調包括VEGF、激酶插入結構域受體(KDR)、eNOS以及血小板內皮細胞黏附分子(CD31) 在內的多個血管生成關鍵基因的表達。在該調控作用下，細胞間連接性顯著增強，并形成了典型的管狀結構，新生血管數量與血管長度顯著增加，充分證明了CuBG-sEVs在促進血管生成方面的顯著效能。

原代間充質干細胞(MSCs) 的募集及其成骨分化在骨再生過程中具有關鍵作用。CuBG-sEVs富含多種與成骨相關的miRNA，如miR-218、miR-146a和miR-21，表現出顯著的成骨潛力。經CuBG-sEVs處理后，多個成骨相關基因的表達均顯著上調，包括堿性磷酸酶(ALP)、runt相關轉錄因子(RUNX2)、骨鈣素(OCN)、骨形態發生蛋白2(BMP2) 和I型膠原α1(COL1A1) 等。其中，ALP和RUNX2的上調在骨基質合成與礦化初期階段起著關鍵作用，而礦化基質含量的增加進一步促進了成骨進程。

CuBG-sEVs中的miRNA不僅可以通過調控Wnt/β-連環蛋白、PI3K/Akt和MAPK信號通路誘導BMSCs向成骨分化，更能精準靶向調控該過程的關鍵靶點，這種多層面的調控機制，充分印證了CuBG-sEVs作為CuBG優質替代品的應用價值。

4.體內血管生成與骨形成

作為遞送載體使用的單寧酸包被明膠甲基丙烯酰基冷凍凝膠(TG)，展現出優異的生物相容性、機械性能和大孔結構。基于這些特性，它能高效吸附自噬體，并能實現對藥物釋放動力學的精準調控。

通過在大鼠顱骨臨界缺損模型中的評估證實，CuBG-sEVs/TG能更有效地促進新骨形成。其療效具體表現為骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th) 的同步顯著增加，凸顯了CuBG-sEVs/TG在骨修復面積與骨再生質量兩方面的全面優勢。

CuBG-sEVs/TG引發了有序的骨愈合過程：缺損區快速形成連續新骨并向中心延伸，同時伴隨細胞外基質的顯著沉積與膠原纖維的致密化、成熟化。這充分證明了高活性CuBG-sEVs的持續釋放能高效促成高質量骨再生。

CuBG-sEVs通過miR-210調控KDR/VEGF/eNOS信號軸，顯著上調了血管關鍵蛋白CD31的表達，從而驅動HUVECs的粘附與聚集，有效促進了血管生成。所形成的血管網絡為骨再生提供了必要的營養支持，其與成骨過程在時空上的高度耦合，表明CuBG-sEVs/TG通過促血管生成為成骨奠定了堅實的微環境基礎。

CuBG-sEVs通過其中的miRNA(如miR-218、miR-146a和miR-21) 上調OCN表達以激活與成骨相關的信號通路；同時，引導骨基質的關鍵成分I型膠原形成有序、與內源性新骨強互聯的結構框架，有效支持細胞遷移、定植及新骨的支持和保護。這兩方面協同作用，共同強化了骨再生過程。

本研究開發了的納米振動激發器CuBG-sEVs，通過HIF-1信號通路將CuBG的離子信號高效轉化為miRNA信號，激活自噬過程，顯著提升CuBG-sEVs產量。由此產生的CuBG-sEVs能被HUVECs和BMSCs快速內化，通過富集的miRNA發揮招募細胞、促進血管生成與成骨分化的雙重效應。

此外，將CuBG-sEVs與TG冷凍凝膠聯合應用于骨缺損部位，CuBG-sEVs通過驅動細胞募集、血管生成與成骨分化這一核心機制，有效支持骨缺損的全面再生；該過程伴隨著加速血管生成與增強I型膠原沉積，從而顯著提高了修復效率。此項工作證實了sEVs作為BG替代方案的巨大潛力，為提升骨再生療效提供了新思路。